FITOCHIMICA - BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

Obiettivi formativi

• FITOCHIMICA

  Il corso ha l’obiettivo di fornire le nozioni fondamentali riguardanti la biosintesi e l’accumulo dei metaboliti secondari nelle specie vegetali, nonché la loro classificazione, il loro ruolo nelle piante, ed il loro utilizzo come indicatori chemotassonomici. Particolare attenzione sarà dedicata alle tecniche di estrazione di metaboliti secondari da diverse matrici vegetali; verranno forniti esempi pratici di studi già eseguiti. Il corso comprenderà anche cenni alle tecniche analitiche attualmente in uso per la determinazione qualitativa e quantitativa di metaboliti secondari in matrici vegetali.

• BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

  Il corso ha l’obiettivo di fornire allo studente le conoscenze di base riguardanti le biotecnologie farmaceutiche applicate agli organismi vegetali. Particolare attenzione sarà dedicata alle piante medicinali ed aromatiche, alla produzione di composti bioattivi di interesse farmaceutico e alla conoscenza dei principali processi biotecnologici innovativi per la produzione di piante medicinali transgeniche, coprendo temi che vanno dalla chimica dei metaboliti secondari in vitro, al loro isolamento e caratterizzazione, alla biologia molecolare, all’ingegneria genetica.

Modalità di svolgimento dell'insegnamento

• FITOCHIMICA

  lezioni frontali

• BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

  Il corso si svolgerà attraverso lezioni frontali ed esercitazioni in aula.

Prerequisiti richiesti

• FITOCHIMICA

  conoscenze base di chimica generale -chimica organica

• BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

  La trasversalità di saperi che caratterizzano la disciplina richiede ampie conoscenze di base di chimica generale inorganica, chimica organica, botanica farmaceutica, biologia vegetale, biochimica vegetale, microbiologia vegetale.

Frequenza lezioni

• FITOCHIMICA

  la frequenza alle lezioni di Fitochimica è altamente consigliata.

• BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

  Numero di ore di lezioni frontali: 36. Numero di ore di esercitazione in aula: 12 - Frequenza obbligatoria (almeno il 70% delle ore totali). La frequenza in aula è obbligatoria, con un percentuale di assenze che non deve superare il 30% delle ore complessive. E’ fortemente consigliato non fare assenze, tranne in casi inevitabili. Durante il corso il docente provvederà ad indicare libri di testo e siti internet di maggiore interesse utilizzabili dallo studente per consultare contenuti e materiale illustrativo utilizzato in aula e/o per autoapprendimento ed autovalutazione.

Contenuti del corso

• FITOCHIMICA

  metaboliti primari e secondari
  ruolo dei metaboliti secondari nelle specie vegetali
  fattori che influenzano il contenuto di metaboliti secondari in una specie vegetale
  I cicli metabolici secondari: la via dell’acetato, la via del mevalonato, la via dello shikimato
  Approfondimenti sui cicli metabolici:
  -caroteni, carotenoidi e apocarotenoidi: il corredo metabolico dello zafferano
  -fenoli semplici e polifenoli: le diverse sottoclassi, dai fenilpropanoidi agli antociani
  -terpeni e terpenoidi: olii essenziali
  -alcaloidi
  Come approcciarsi ad una matrice vegetale, tecniche estrattive per metaboliti volatili e non volatili: estrazione semplice, estrazione a cascata, idrodistillazione, distillazione in corrente di vapore, cenni sulle estrazioni non convenzionali
  Tecniche analitiche attualmente in uso per la determinazione di metaboliti volatili e non volatili in specie vegetali (cenni); chemotassonomia (cenni ed esempi)
  Casi studio discussi in aula

• BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

  Durante il corso lo studente parteciperà a lezioni frontali. Durante le lezioni saranno illustrati gli aspetti teorici relativi alle colture di tessuti vegetali, di antere e di sospensioni cellulari, alle tecniche di propagazione, micropropagazione, organogenesi, embriogenesi e di isolamento e fusione di protoplasti e trasformazione genetica di una pianta attraverso metodi di ingegneria genetica. Il programma del corso (6 CFU totali) è così suddiviso:

  Modulo I – 1CFU

  • INTRODUZIONE ALLE BIOTECNOLOGIE VEGETALI. Definizione, storia, evoluzione.
  • LA COLTURA DEI TESSUTI VEGETALI IN VITRO. Cenni storici della coltura dei tessuti vegetali. Organizzazione del laboratorio, le camere di coltura, i mezzi di coltura, fitoregolatori di crescita delle piante (auxine, citochinine, giberelline, acido abscissico, etilene). Colture in terreni liquidi. Colture su terreni solidi: agar e sistemi di supporto per le colture vegetali.
  • TECNICHE DI STERILIZZAZIONE E INDESSAGGIO. Filtrazione, sterilizzazione a secco, sterilizzazione a vapore, uso di raggi UV. Sterilizzazione di strumentazione e mezzi di coltura, sterilizzazione di tessuti vegetali. Cappe a flusso laminare verticale e orizzontale. Indessaggio: tecniche, fasi principali, indessaggio dei virus, saggi sierologici (ELISA), biosaggi, produzione di piante virus-free.
  • SCELTA DELL’ESPIANTO. Momento stagionale, tipo e dimensioni dell’espianto, espianto da tessuti specifici. Vantaggi e svantaggi dei singoli espianti.

  Modulo II –5CFU

  • TECNICHE DI PROPAGAZIONE E MICROPROPAGAZIONE. Biotecnologie tradizionali: selezione, ibridazione, incrocio ed addomesticamento per il miglioramento delle colture officinali. Biotecnologie innovative: colture in vitro di cellule vegetali, tessuti e organi - tecniche relative, micropropagazione, ingegneria genetica o tecnologia del DNA ricombinante - piante e organismi transgenici, crioconservazione del germoplasma. Micropropagazione: coltura di meristemi e apici meristematici, coltura di germogli, coltura di segmenti nodali. Eliminazione di patogeni dalla pianta madre: chemioterapia, termoterapia. Stadi della micropropagazione: 0, I - impianto della coltura settica, II - proliferazione dei germogli, III - pre-trapianto e radicazione, IV - trasferimento all’ambiente esterno. Vantaggi e svantaggi della micropropagazione.
  • COLTURA DI SOSPENSIONI CELLULARI. Colture in terreno liquido stazionario, ad immersione periodica, ad immersione permanente (colture in sospensione): coltura discontinua, continua (aperta o chiusa), semi-continua, coltura di cellule immobilizzate. Curva di crescita cellulare: fase di latenza, fase di accelerazione, fase esponenziale, fase di decelerazione, fase stazionaria. Colture sincronizzate: sincronizzazione per selezione e per induzione. Metodi di induzione: trattamento a freddo, affamamento, uso di inibitori, metodo della colchicina. Controllo della crescita cellulare in colture in sospensione: vitalità e crescita cellulare. Crescita cellulare: conta cellulare, peso fresco (fw), volume di cellule impaccate (pcv), peso secco (dw).
  • PRODUZIONE DI METABOLITI SECONDARI IN VITRO. Vantaggi e svantaggi. Selezione di linee cellulari altamente produttive. Influenza della presenza nel terreno di coltura di: zuccheri, nitrato, azoto, fosfato, PGR, fornitura di precursori, b-ciclodestrine. Ottimizzazione dell’ambiente di coltura: temperatura, illuminazione, pH, agitazione e areazione. Elicitazione ed elicitori. Permeabilizzazione. Rimozione del prodotto in situ. Immobilizzazione. Matrici. Vantaggi e svantaggi. Esempi di produzione di principi attivi e sostanze di interesse farmaceutico e farmaco-tecnologico.
  • ISOLAMENTO, COLTURA E FUSIONE DI PROTOPLASTI. Storia e definizioni: protoplasto e parete cellulare. Isolamento di protoplasti: metodo meccanico e metodo enzimatico. Fasi dell’isolamento di protoplasti: scelta del tipo di espianto, scelta della miscela enzimatica appropriata, rimozione dell’epidermide, plasmolisi dei tessuti, digestione enzimatica, sospensione e lavaggio protoplasti, stima del numero e della vitalità dei protoplasti isolati, messa in coltura. Fattori influenzanti crescita e sviluppo di protoplasti. Formazione della parete cellulare. Fusione di protoplasti ed ibridazione somatica. Storia, definizioni e nozioni di base. Tipi di ibridi: somatici, asimmetrici, cibridi. Stadi dell’ibridazione somatica: fusione di protoplasti (spontanea o indotta), selezione delle cellule ibride, identificazione delle piante ibride. Fusione diretta e indotta. Meccanismo di fusione. Metodi di fusione: trattamento con NaNO₃, Trattamento con ioni Ca⁺⁺ ad elevato pH, metodo del polietilenglicole (PEG), elettrofusione. Identificazione e selezione delle cellule ibride: uso di markers di resistenza, uso di caratteristiche visuali e coloranti vitali. Esempi. Applicazioni dell’ibridazione somatica.

  • TECNICHE DI INGEGNERIA GENETICA. PGM e OGM: storia e definizioni. Vettori molecolari, plasmidi, enzimi di restrizione, DNA ligasi, polymerase chain reaction e amplificazione del DNA (PCR). PGM di prima e seconda generazione. Trasformazione delle piante. Fasi procedurali per la produzione di PGM: isolamento e caratterizzazione di un gene, preparazione del costrutto, trasformazione, analisi e scelta delle linee transgeniche, introgressione del transgene in linee più produttive, prove di campo. Metodi di trasformazione. Trasformazione diretta: elettroporazione di protoplasti, microiniezione. Trasformazione in planta: metodi biolistici, metodi dell’Agrobacterium tumefaciens e rizhogenes. Vantaggi e limiti di ciascun metodo. Costruzione di un vettore di clonazione basato sul plasmide Ti: sistema del vettore binario, sistema del vettore cointegrativo. Triparental mating. Analisi e scelta delle linee cellulari transgeniche. Metodi di selezione: resistenza agli antibiotici, resistenza agli erbicidi, introduzione di geni reporter. Vantaggi e problematiche. Trasferimento genico mediato da Agrobacterium rhizogenes: hairy roots. Esempi di prodotti ottenuti da coltivazione di hairy roots.
  • OGM E NORMATIVA EUROPEA E NAZIONALE VIGENTE IN MATERIA DI OGM. Direttive su: rilasci nell’ambiente, alimenti e mangimi, tracciabilità e etichettatura, movimenti transfrontalieri degli OGM. Principio di precauzione. Esempi di prodotti commercializzati e meccanismi d'azione dei geni esogeni introdotti: pomodoro flavr savr, olio di colza laurical, zucchino freedom II, cotone bollgard, soia round-up ready, mais maximizer e nature gard.
  • CONSERVAZIONE DEL GERMOPLASMA E CRIOCONSERVAZIONE. Quadro normativo e convenzioni sulla tutela della biodiversità. Conservazione in situ ed ex situ. Reti di banche del germoplasma. Raccolta del germoplasma. Trasferimento del germoplasma. Trattamento del germoplasma prima della conservazione. Imballaggio e conservazione. Crioconservazione. Stadi della crioconservazione. Germinazione. Gestione del germoplasma. Approfondimenti.

  • ORGANOGENESI. Meristemoidi, primordi. Organogenesi diretta, organogenesi indiretta. Caulogenesi, rizogenesi. Fasi dell’organogenesi: espianto, de-differenziazione, competenza, induzione, determinazione, differenziazione, organo. Applicazioni alla propagazione di piante officinali e all’ottenimento di metaboliti secondari di interesse farmaceutico e farmaco-tecnologico.
  • EMBRIOGENESI. Embriogenesi zigotica (sessuale) e non-zigotica (somatica). Protocolli di coltura embriogenica. Origine di embrioni non-zigotici. Induzione di cellule embriogeniche e uso di PGR. Sviluppo e maturazione dell’embrione. Quiescenza e dormienza. Germinazione dell’embrione e sviluppo della pianta. Applicazioni delle colture embriogeniche. Tecnologia dei semi sintetici e incapsulamento.

Testi di riferimento

• FITOCHIMICA

  Cicli metabolici e classificazione dei metaboliti secondari: Alessandro Bruni, Biologia Farmaceutica, Edizioni Pearson, Capitolo 7 (pagg. 127-171); per approfondire Paul M. Dewick, Chimica biosintesi e bioattività delle sostanze naturali, Casa Editrice Piccin
  Tecniche estrattive e cenni su tecniche analitiche applicate allo studio di matrici vegetali: Marco D’ischia, La Chimica organica in laboratorio, Casa Editrice Piccin:
  Capitolo 2.5 (pag. 98-105); Capitolo 3.1 (pag. 111-120); Capitolo 3.2 (pag. 121-132); Capitolo 3.7 (pag. 152-163); capitolo 3.8 (pag. 164-182); Capitolo 4 (pag. 197-199); Capitolo 4.3 (pag. 219-238); Capitolo 6.2 (pag. 384-395); Capitolo 8.4 (pag. 639-653).

  Approfondimenti: dispense del docente e appunti di lezione.

• BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

  TESTI DI RIFERIMENTO:

  • Slides delle lezioni. Disponibili su STUDIUM (utilizzare come password: pittala) per l’anno accademico in corso
  • Trigiano R.N., Gray D.J. “La Coltura dei Tessuti Vegetali” Edagricole, Bologna, Italia.
  • Siti internet indicati dal docente
  • Gianluigi Bacchetta, Piero Belletti, Salvatore Brullo, Luisa Cagelli, Valentina Carasso, Josè, Luis Casas, Claudio Cervelli, M. Carmen Escribà, Giuseppe Fenu, Fabio Gorian, Jaime Güemes1, Efisio Mattana, Massimo Nepi, Ettore Pacini, Pietro Pavone, Beti Piotto, Cristiano, Pontecorvo, Aranxta Prada, Gianfranco Venora, Lorenzo Vietto, Myriam Virevaire. APAT - Agenzia per la protezione dell’ambiente e per i servizi tecnici. Manuale per la raccolta, studio, conservazione e gestione ex situ del germoplasma.

   

  TESTI DA CONSULTARE:

  • Chawla H.S. “Introduction to plant biotechnology”, Springer, Netherlands.
  • Sala F., Cella R. “Colture Vegetali.Maffei M. "Metabolismo e Prodotti Secondari delle Piante" 1999, UTET Libreria Srl, Torino, Italia.
  • Glick B.R., Pastrernak J.J “Biotecnologia Molecolare - Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante” 2003, Zanichelli.

Programmazione del corso

Verifica dell'apprendimento

Modalità di verifica dell'apprendimento

• BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

  PROVA D’ESAME:

  L’esame consiste in due prove in itinere contenenti ciascuna una domanda aperta. Infine gli studenti effettueranno una presentazione orale su un argomento approfondito e concordato durante l’anno.

  In alternativa per chi non desidera sostenere le prove in itinere, l’esame consiste in un compito scritto contenente tre domande aperte. La durata della prova è di due ore. Per sostenere l'esame è obbligatorio prenotarsi tramite l'apposito portale dello studente prima del singolo appello.

  Le date degli appelli sono riportate nel calendario d’esame pubblicato sul seguente sito web: http://www.dsf.unict.it/sites/default/files/calendario_esami/ORARIO%20CDL%20SFA%20%202015-16.pdf

  La valutazione avrà l’obiettivo di accertare l’acquisizione da parte dello studente delle conoscenze relative ai principali processi biotecnologici per la produzione di piante officinali transgeniche e di metaboliti secondari di interesse farmaceutico, insieme alle tecniche più importanti di conservazione del germoplasma per la tutela della biodiversità di una data specie.

  Su richiesta dello studente (via e-mail e in data precedente al giorno dell’esame) è possibile sostenere l’esame in forma orale in alternativa al test scritto.

Esempi di domande e/o esercizi frequenti

• BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

  1) Parlare dei terreni di coltura

  2) Parlare delle tecniche di sterilizzazione e di indessaggio

  3) Parlare dei fitoregolatori di crescita

  4) Parlare della coltura di sospensioni cellulari

  5) Parlare della produzione di metaboliti secondari

  6) Parlare dell'isolamento e fusione di protoplasti

  7) Parlare delle techiche di ingengneria genetica OGM e PGM