ANALISI CHIMICA TOSSICOLOGICA I

• Fornire allo studente le conoscenze teoriche e pratiche dell’analisi chimica tossicologica e le sue applicazioni
• Presentare le principali metodologie di prelievo, manipolazione e preparazione del campione
• Fornire concetti sulle principali tecniche analitiche

Conoscenze di base di chimica generale: La materia: definizione e proprietà, stati di aggregazione della materia, gli elementi e composti chimici. Definizione e formule chimiche: principali classi di composti inorganici. Concetto di acido e base, definizione di pH. Sistema periodico degli elementi. Sostanze, elementi, miscele e composti, Concetto di reazione chimica, principali tipologie di reazioni. La mole: definizione e sue principali applicazioni. l'atomo e cenni sulla struttura atomica.

Conoscenze di base di fisica: Grandezze fisiche e unità di misura, S.I.. cinematica, leggi fondamentali della dinamica classica, termologia, pressione e leggi dei gas, idrostatica, elettrostatica, corrente elettrica e leggi di Ohm. .

Conoscenze di base di matematica, statistica e informatica: Aree, volumi, angoli, notazione scientifica, frazioni, percentuali, proporzioni,radicali, potenze, logaritmi, equivalenze, equazioni algebriche, funzioni trigonometriche, sistemi di riferimento cartesiani, equazione della retta

La frequenza ai corsi per gli iscritti non fuori corso è obbligatoria. Per essere ammessi agli esami sono consentite assenze per non più del 30% delle ore complessive di lezione valutate in tutte le loro forme di espletamento. Gli studenti possono chiedere la dispensa totale o parziale dall’obbligo della frequenza delle lezioni teoriche per gravi e giustificati motivi di lavoro o di salute. La dispensa è deliberata dal Consiglio del corso di studio.

Primo modulo

Principi di Analisi di Chimica Tossicologica: Metodologia generale. Il metodo analitico, definizione di veleno. Impostazione dell’analisi: analisi generica e mirata. Test di screening preliminari: Test immunologici, cromatografia su strato sottile, Spot test o test colorimetrici. Interpretazione del dato analitico. Valutazione del dato chimico positivo e negativo. Tipologie di campioni (sangue, umore vitreo, il liquido cerebrospinale, contenuto gastrico, urine, tessuti, saliva, sudore).

Metodi di estrazione: Metodi separativi e non separativi. Classificazione analitica delle sostanze tossiche:

Gassosi e volatili.

• Estrazione a caldo in vial chiuso (Spazio di testa), principi generali. Equilibrio di distribuzione, coefficiente di ripartizione, rapporto di fase, salting out.
• Estrazione per microdiffusione, principi generali. Estrazione per microdiffusione del monossido di carbonio. Estrazione per microdiffusione del cianuro di sodio.

Distillabili in corrente di vapore: principi generali. Acidi e Basi forti: principi generali. Metalli: principi generali, test di Reinsch. Preparazione del campione per la ricerca dei metalli. Anioni Tossici: principi generali. Misti e organici non separabili con solventi: principi generali

Organici estraibili con solventi: aspetti generali

• Solubilità e coefficiente di ripartizione. Principi generali e LogP
• Equilibrio di dissociazione elettrolitica, costante di dissociazione e lo stato di ionizzazione. Comportamento di distribuzione di acidi, basi e sostanze anfotere.
• Ion pair extraction. Bromuro di cetil-trimetilammonio, Blu di bromotimolo, Bromocresolo verde, blu di bromofenolo. Estrazione del paracquat.
• Uso di standard interni
• Analisi di metaboliti glucoronati o coniugati: idrolisi chimica ed enzimatica
• Pretrattamento del campione, omogeneizzazione e eliminazione delle proteine. Digestione enzimatica e chimica.
• Tamponi. Preparazione di tamponi al valore di pH desiderato e uso di questi tamponi nelle estrazioni. Tamponi a un componente, tamponi a due componenti. Applicazioni dell’equazione di Henderson-Hasselbalch
• Soluzioni, uso e preparazione. Sodio idrossido, acido cloridrico, acido solforico, sodio borato.
• Tipi di solvente e scelta del solvente. Clorobutano, etile acetato, esano, cicloesano, metanolo, etanolo, acetonitrile, cloroformio, diclorometano, etere dietilico.

Estrazione liquido-liquido

• Resa di estrazione. Equilibrio di distribuzione, equilibrio di dissociazione elettrolitica, rapporto di fase, numero di fasi di estrazione. Salting out. Tipi di solvente e scelta del solvente. Schema di estrazione sostanza basica. Schema di estrazione sostanze acide e neutre. Meccanismo chimico di separazione di sostanze di natura acida/basica/neutra. Procedura di estrazione dell’aspirina. Procedura di estrazione della caffeina.

Estrazione solido-liquido (SPE)

• Considerazioni generali. Campi di applicazione. Tipi di interazioni con la fase solida. Tipi di fase solida. Tipi di solvente e scelta del solvente. Meccanismo chimico di separazione di sostanze di natura acida/basica/neutra. Pretrattamento del campione. Pretrattamento della fase stazionaria. Applicazione del campione. Fasi di lavaggio. Rimozione e raccolta dei contaminanti. Raccolta dell’analita. Estrazione SPE della Difenidramina.

Saggi colorimetrici: introduzione e interpretazione dei saggi colorimetrici, tipologie e metodologie di saggi colorimetrici. Saggi di riconoscimento: Cloruro ferrico, Marquis reagent, Mandelin reagent, McNally’s test.

Secondo modulo

Spettroscopia UV – Visibile: Principi generali, la radiazione elettromagnetica (Ampiezza, periodo, frequenza, lunghezza d’onda). Cromoforo. Analisi quantitativa, trasmittanza, assorbanza, Legge di Lambert – Beer, effetto batocromico, ipsocromico, ipercromico, ipocromico e auxocromo. Effetto solvente. Strumentazione: Generalità sugli spettrofotometri, la sorgente, il monocromatore, la cella, i rivelatori. Tipi di spettrofotometro: spettrofotometri monoraggio, doppio raggio e a serie di diodi.

Metodi cromatografici: Principi generali della cromatografia. Cromatogramma. Velocità di migrazione, tempo morto e tempo di ritenzione, volume morto e volume di ritenzione. Efficienza di una colonna. Il modello dei piatti teorici. Equazione di Van Deemter, diffusione turbolenta, diffusione molecolare longitudinale, trasferimento di massa. Ottimizzazione dell’efficienza. Selettività. Risoluzione. Meccanismi di separazione: adsorbimento, ripartizione, scambio ionico, esclusione

• Cromatografia su strato sottile TLC (Thin-Layer Chromatography). Strumentazione ed esecuzione. Fattore di ritenzione. Lastrine e fasi stazionarie. Serie eluotropa e fasi mobili. Visualizzazione della lastrina. Derivatizzazione, Dragendorff reagent. Selettività, capacità, efficienza e risoluzione.
• Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Caratteristiche e vantaggi. Altezza equivalente ad un piatto teorico. Cromatografia in fase diretta e in fase inversa. Caratteristiche di una colonna HPLC. La fase mobile e solventi per fase mobile in HPLC. Modificatori per fase mobile, tamponi, acidificatori, reagenti di coppia ionica, modificatori basici. Filtrazione dei solventi e degasaggio. Condizioni operative: eluizione isocratica e a gradiente. Strumentazione HPLC: pompe per HPLC, pompe reciprocanti, iniettore manuali. Tipi di rivelatori per HPLC. Rivelatori UV-Vis, la cella a flusso, rivelatore ad assorbanza UV-Vis a lunghezza d’onda variabile, rivelatore a serie di diodi.

Terzo modulo

Spettrometria di massa (MS). Principi generali. Lo spettro di massa. Massa di uno ione e dalton. Picchi isotopici e intensità dei picchi isotopici. Massa nominale e massa esatta. Risoluzione dello strumento e potere risolutivo. Elementi costitutivi di uno spettrometro di massa:

• Sistemi di introduzione del campione. Via diretta e indiretta
• Ionizzazione. Il processo di ionizzazione. Classificazione dei metodi di ionizzazione. Tecniche hard e soft, ionizzazione per vaporizzazione, desorbimento e nebulizzazione.
  • Ionizzazione elettronica. Principi generali, la camera di ionizzazione, formazione dello ione molecolare e frammentazione. Sorgente a ionizzazione elettronica, caratteristiche, limiti e vantaggi.
  • Ionizzazione chimica. principi generali. Ionizzazione chimica e ionizzazione elettronica differenze. Tipi e caratteristiche dei gas reagenti. Formazione di addotti. Metano, ammoniaca e affinità protonica. Scelta del gas reagente.
  • FAB e MALDI. principi generali e campi di applicazione. Tipi di matrice.
  • ionizzazione elettrospray. Principi generali. Nebulizzazione. Evaporazione del solvente. Composizione della camera elettrospray, capillare, cono e controelettrodo. Formazione degli ioni. Ione molecolare e ioni multicarica.

• Analizzatori: tipi di analizzatore
  • Analizzatore magnetico: caratteristiche e funzionamento. Energia cinetica degli ioni. Traiettoria degli ioni nell’analizzatore magnetico. Equazione fondamentale dell’analizzatore magnetico
  • Analizzatore filtro di massa quadrupolo: caratteristiche e funzionamento. Oscillazioni stabili e instabili
  • Analizzatore TOF (time-of- flights): caratteristiche e funzionamento. Velocità e tempo degli ioni. Equazioni fondamentali.
• Rivelatori: caratteristiche e funzionamento. Dinodo di conversione e moltiplicatore di elettroni a dinodo continuo.
• Calcolatore: caratteristiche e funzionamento.

Principali tipi di ioni: ione molecolare, di frammentazione, di riarrangiamento, a carica multipla, metastabili, negativi, interazione ione molecola. Riconoscimento dello ione molecolare. Differenza nello spettro di massa e nello ione molecolare in base al tipo di camera di ionizzazione usata. Intensità dello ione molecolare e regola dell’azoto.

Cromatografia liquida-Spettrometria di massa (LCMS). Caratteristiche e funzionamento

• Dispensa, slides e appunti Docente
• Moffat A.C., Osselton M.D., Widdop B. - Clarke’s analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material - Pharmaceutical Press 2011
• Gagliano-Candela R. - Tossicologia forense in schemi, tabelle e testo - Giuffrè Editore 2001
• Flanagan R.J., Brainthwaite R.A., Brown S.S., Widdop B., De Wolff F.A. - Basic analytical toxicology - WHO World Health Organization 1995
• Flanagan R.J., Taylor A., Watson I.D., Whelpton R. - Fundamentals of analytical toxicology - John Wiley & Sons Ltd 2007

Esame scritto o orale

• Estrazione Liquido-Liquido si tossico organico di natura basica
• Estrazione Liquido-Liquido si tossico organico di natura acida
• Estrazione Solido-Liquido si tossico organico di natura basica
• Estrazione Solido-Liquido si tossico organico di natura acida
• Estrazione per microdiffusione
• Estrazione di sostanze volatili tramite la tecnica dello spazio di testa
• Tamponi preparazione e utilizzo
• Soluzioni acquose preparazioni e utilizzo
• Legge di Planck
• Analizzatore magnetico
• Analizzatore TOF
• Analizzatore quadrupolo
• Impatto elettronico
• Ionizzazione Chimica
• Electrospray
• TLC
• Pompe per HPLC
• Iniettore per HPLC
• HPLC metodologia generale
• Colonne per HPLC
• Flusso e solventi per HPLC
• Solventi per TLC
• Eluizione isocratica e a gradiente
• Spettro di massa
• Cromatogramma
• Spettro UV-Vis
• Effetto batocromico
• Effetto ipsocromico
• Effetto ipo e ipercromico
• Coefficiente di estinzione molare
• Legge di lambert-beer
• DAD
• Spettrofotometria UV-Vis strumentazione
• Lastrine per TLC
• Potere eluotropo e conseguente eluizione in TLC
• Cromatografia, considerazioni generali
• Classificazione delle sostanze tossiche
• Definizione di veleno
• Estrazione liquido-liquido
• Estrazione solido-liquido
• Parametri che influenzano l'estrazione di sostanze organiche: solubilita', pKa, logP, Coefficiente di ripartizione.
• Estrazione di sostanze anfotere
• Ione molecolare
• Massa esatta e massa nominale
• Dalton
• La camera di ionizzazione
• Fab e maldi
• Risoluzione e selettivita' in cromatografia
• Equazione di Van Deemter
• Saggi colorimetrici
• Saggio di Marquis
• Reazione di Diazocopulazione
• Saggio di Mandelin
• Saggio del Cloruro Ferrico
• Parametri che influenzano il coefficiente di ripartizione nella estrazione spazio di testa