FITOCHIMICA - BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

Modulo BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE APPLICATE ALLE PIANTE OFFICINALI

Il corso ha l’obiettivo di fornire allo studente le conoscenze di base riguardanti le biotecnologie farmaceutiche applicate agli organismi vegetali. Particolare attenzione sarà dedicata alle piante medicinali ed aromatiche, alla produzione di composti bioattivi di interesse farmaceutico e alla conoscenza dei principali processi biotecnologici innovativi per la produzione di piante medicinali transgeniche, coprendo temi che vanno dalla chimica dei metaboliti secondari in vitro, al loro isolamento e caratterizzazione, alla biologia molecolare, all’ingegneria genetica.

Il corso si svolgerà attraverso lezioni frontali. Qualora l'insegnamento venisse impartito in modalità mista o a distanza potranno essere introdotte le necessarie variazioni rispetto a quanto dichiarato in precedenza, al fine di rispettare il programma previsto e riportato nel syllabus.

"Informazioni per studenti con disabilità e/o DSA
 
A garanzia di pari opportunità e nel rispetto delle leggi vigenti, gli studenti interessati possono chiedere un colloquio personale in modo da programmare eventuali misure compensative e/o dispensative, in base agli obiettivi didattici ed alle specifiche esigenze.
E' possibile rivolgersi anche al docente referente CInAP (Centro per l’integrazione Attiva e Partecipata - Servizi per le Disabilità e/o i DSA) del nostro Dipartimento, prof.ssa Santina Chiechio"

La trasversalità di saperi che caratterizzano la disciplina richiede ampie conoscenze di base di chimica generale inorganica, chimica organica, botanica, biologia vegetale, biochimica, microbiologia.

Numero di ore di lezioni frontali: 42 - Frequenza obbligatoria secondo le norme del regolamento didattico del CdS in SFA come riportato nel link: http://www.dsf.unict.it/corsi/l-29_sfa/regolamento-didattico.E’ fortemente consigliato non fare assenze, tranne in casi inevitabili. Durante il corso il docente provvederà ad indicare libri di testo e siti internet di maggiore interesse utilizzabili dallo studente per consultare contenuti e materiale illustrativo utilizzato in aula e/o per autoapprendimento ed autovalutazione.

Durante il corso lo studente parteciperà a lezioni frontali. Durante le lezioni saranno illustrati gli aspetti teorici relativi alle colture di tessuti vegetali, di antere e di sospensioni cellulari, alle tecniche di propagazione, micropropagazione, organogenesi, embriogenesi e di isolamento e fusione di protoplasti e trasformazione genetica di una pianta attraverso metodi di ingegneria genetica. Il programma del corso (6 CFU totali) è così suddiviso:

Modulo I – 1CFU

• INTRODUZIONE ALLE BIOTECNOLOGIE VEGETALI. Definizione, storia, evoluzione.
• LA COLTURA DEI TESSUTI VEGETALI IN VITRO. Cenni storici della coltura dei tessuti vegetali. Organizzazione del laboratorio, le camere di coltura, i mezzi di coltura, fitoregolatori di crescita delle piante (auxine, citochinine, giberelline, acido abscissico, etilene). Colture in terreni liquidi. Colture su terreni solidi: agar e sistemi di supporto per le colture vegetali.
• TECNICHE DI STERILIZZAZIONE E INDESSAGGIO. Filtrazione, sterilizzazione a secco, sterilizzazione a vapore, uso di raggi UV. Sterilizzazione di strumentazione e mezzi di coltura, sterilizzazione di tessuti vegetali. Cappe a flusso laminare verticale e orizzontale. Indessaggio: tecniche, fasi principali, indessaggio dei virus, saggi sierologici (ELISA), biosaggi, produzione di piante virus-free.
• SCELTA DELL’ESPIANTO. Momento stagionale, tipo e dimensioni dell’espianto, espianto da tessuti specifici. Vantaggi e svantaggi dei singoli espianti.

Modulo II –5CFU

• TECNICHE DI PROPAGAZIONE E MICROPROPAGAZIONE. Biotecnologie tradizionali: selezione, ibridazione, incrocio ed addomesticamento per il miglioramento delle colture officinali. Biotecnologie innovative: colture in vitro di cellule vegetali, tessuti e organi - tecniche relative, micropropagazione, ingegneria genetica o tecnologia del DNA ricombinante - piante e organismi transgenici, crioconservazione del germoplasma. Micropropagazione: coltura di meristemi e apici meristematici, coltura di germogli, coltura di segmenti nodali. Eliminazione di patogeni dalla pianta madre: chemioterapia, termoterapia. Stadi della micropropagazione: 0, I - impianto della coltura settica, II - proliferazione dei germogli, III - pre-trapianto e radicazione, IV - trasferimento all’ambiente esterno. Vantaggi e svantaggi della micropropagazione.
• COLTURA DI SOSPENSIONI CELLULARI. Colture in terreno liquido stazionario, ad immersione periodica, ad immersione permanente (colture in sospensione): coltura discontinua, continua (aperta o chiusa), semi-continua, coltura di cellule immobilizzate. Curva di crescita cellulare: fase di latenza, fase di accelerazione, fase esponenziale, fase di decelerazione, fase stazionaria. Colture sincronizzate: sincronizzazione per selezione e per induzione. Metodi di induzione: trattamento a freddo, affamamento, uso di inibitori, metodo della colchicina. Controllo della crescita cellulare in colture in sospensione: vitalità e crescita cellulare. Crescita cellulare: conta cellulare, peso fresco (fw), volume di cellule impaccate (pcv), peso secco (dw).
• PRODUZIONE DI METABOLITI SECONDARI IN VITRO. Vantaggi e svantaggi. Selezione di linee cellulari altamente produttive. Influenza della presenza nel terreno di coltura di: zuccheri, nitrato, azoto, fosfato, PGR, fornitura di precursori, b-ciclodestrine. Ottimizzazione dell’ambiente di coltura: temperatura, illuminazione, pH, agitazione e areazione. Elicitazione ed elicitori. Permeabilizzazione. Rimozione del prodotto in situ. Immobilizzazione. Matrici. Vantaggi e svantaggi. Esempi di produzione di principi attivi e sostanze di interesse farmaceutico e farmaco-tecnologico.
• ISOLAMENTO, COLTURA E FUSIONE DI PROTOPLASTI. Storia e definizioni: protoplasto e parete cellulare. Isolamento di protoplasti: metodo meccanico e metodo enzimatico. Fasi dell’isolamento di protoplasti: scelta del tipo di espianto, scelta della miscela enzimatica appropriata, rimozione dell’epidermide, plasmolisi dei tessuti, digestione enzimatica, sospensione e lavaggio protoplasti, stima del numero e della vitalità dei protoplasti isolati, messa in coltura. Fattori influenzanti crescita e sviluppo di protoplasti. Formazione della parete cellulare. Fusione di protoplasti ed ibridazione somatica. Storia, definizioni e nozioni di base. Tipi di ibridi: somatici, asimmetrici, cibridi. Stadi dell’ibridazione somatica: fusione di protoplasti (spontanea o indotta), selezione delle cellule ibride, identificazione delle piante ibride. Fusione diretta e indotta. Meccanismo di fusione. Metodi di fusione: trattamento con NaNO₃, Trattamento con ioni Ca⁺⁺ ad elevato pH, metodo del polietilenglicole (PEG), elettrofusione. Identificazione e selezione delle cellule ibride: uso di markers di resistenza, uso di caratteristiche visuali e coloranti vitali. Esempi. Applicazioni dell’ibridazione somatica.

• TECNICHE DI INGEGNERIA GENETICA. PGM e OGM: storia e definizioni. Vettori molecolari, plasmidi, enzimi di restrizione, DNA ligasi, polymerase chain reaction e amplificazione del DNA (PCR). PGM di prima e seconda generazione. Trasformazione delle piante. Fasi procedurali per la produzione di PGM: isolamento e caratterizzazione di un gene, preparazione del costrutto, trasformazione, analisi e scelta delle linee transgeniche, introgressione del transgene in linee più produttive, prove di campo. Metodi di trasformazione. Trasformazione diretta: elettroporazione di protoplasti, microiniezione. Trasformazione in planta: metodi biolistici, metodi dell’Agrobacterium tumefaciens e rizhogenes. Vantaggi e limiti di ciascun metodo. Costruzione di un vettore di clonazione basato sul plasmide Ti: sistema del vettore binario, sistema del vettore cointegrativo. Triparental mating. Analisi e scelta delle linee cellulari transgeniche. Metodi di selezione: resistenza agli antibiotici, resistenza agli erbicidi, introduzione di geni reporter. Vantaggi e problematiche. Trasferimento genico mediato da Agrobacterium rhizogenes: hairy roots. Esempi di prodotti ottenuti da coltivazione di hairy roots.
• OGM E NORMATIVA EUROPEA E NAZIONALE VIGENTE IN MATERIA DI OGM. Direttive su: rilasci nell’ambiente, alimenti e mangimi, tracciabilità e etichettatura, movimenti transfrontalieri degli OGM. Principio di precauzione. Esempi di prodotti commercializzati e meccanismi d'azione dei geni esogeni introdotti: pomodoro flavr savr, olio di colza laurical, zucchino freedom II, cotone bollgard, soia round-up ready, mais maximizer e nature gard.
• CONSERVAZIONE DEL GERMOPLASMA E CRIOCONSERVAZIONE. Quadro normativo e convenzioni sulla tutela della biodiversità. Conservazione in situ ed ex situ. Reti di banche del germoplasma. Raccolta del germoplasma. Trasferimento del germoplasma. Trattamento del germoplasma prima della conservazione. Imballaggio e conservazione. Crioconservazione. Stadi della crioconservazione. Germinazione. Gestione del germoplasma. Approfondimenti.

• ORGANOGENESI. Meristemoidi, primordi. Organogenesi diretta, organogenesi indiretta. Caulogenesi, rizogenesi. Fasi dell’organogenesi: espianto, de-differenziazione, competenza, induzione, determinazione, differenziazione, organo. Applicazioni alla propagazione di piante officinali e all’ottenimento di metaboliti secondari di interesse farmaceutico e farmaco-tecnologico.
• EMBRIOGENESI. Embriogenesi zigotica (sessuale) e non-zigotica (somatica). Protocolli di coltura embriogenica. Origine di embrioni non-zigotici. Induzione di cellule embriogeniche e uso di PGR. Sviluppo e maturazione dell’embrione. Quiescenza e dormienza. Germinazione dell’embrione e sviluppo della pianta. Applicazioni delle colture embriogeniche. Tecnologia dei semi sintetici e incapsulamento.

Qualora l'insegnamento venisse impartito in modalità mista o a distanza potranno essere introdotte le necessarie variazioni rispetto a quanto dichiarato in precedenza, al fine di rispettare il programma previsto e riportato nel syllabus.

Informazioni per studenti con disabilità e/o DSA

A garanzia di pari opportunità e nel rispetto delle leggi vigenti, gli studenti interessati possono chiedere un colloquio personale in modo da programmare eventuali misure compensative e/o dispensative, in base agli obiettivi didattici ed alle specifiche esigenze. E' possibile rivolgersi anche al docente referente CInAP (Centro per l’integrazione Attiva e Partecipata Servizi per le Disabilità e/o i DSA) del nostro Dipartimento, prof.ssa Santina Chiechio.

TESTI DI RIFERIMENTO:

• Slides delle lezioni. Disponibili su STUDIUM (utilizzare come password: pittala) per l’anno accademico in corso
• Trigiano R.N., Gray D.J. “La Coltura dei Tessuti Vegetali” Edagricole, Bologna, Italia.
• Siti internet indicati dal docente
• Gianluigi Bacchetta, Piero Belletti, Salvatore Brullo, Luisa Cagelli, Valentina Carasso, Josè, Luis Casas, Claudio Cervelli, M. Carmen Escribà, Giuseppe Fenu, Fabio Gorian, Jaime Güemes1, Efisio Mattana, Massimo Nepi, Ettore Pacini, Pietro Pavone, Beti Piotto, Cristiano, Pontecorvo, Aranxta Prada, Gianfranco Venora, Lorenzo Vietto, Myriam Virevaire. APAT - Agenzia per la protezione dell’ambiente e per i servizi tecnici. Manuale per la raccolta, studio, conservazione e gestione ex situ del germoplasma.

TESTI DA CONSULTARE:

• Chawla H.S. “Introduction to plant biotechnology”, Springer, Netherlands.
• Sala F., Cella R. “Colture Vegetali.Maffei M. "Metabolismo e Prodotti Secondari delle Piante" 1999, UTET Libreria Srl, Torino, Italia.
• Glick B.R., Pastrernak J.J “Biotecnologia Molecolare - Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante” 2003, Zanichelli.

PROVA D’ESAME:

L’esame consiste in un compito scritto contenente tre domande aperte. La durata della prova è di due ore. Per sostenere l'esame è obbligatorio prenotarsi tramite l'apposito portale dello studente prima del singolo appello.

Le date degli appelli sono riportate nel calendario d’esame pubblicato sul seguente sito web: http://www.dsf.unict.it/corsi/l-29_sfa.

La valutazione avrà l’obiettivo di accertare l’acquisizione da parte dello studente delle conoscenze relative ai principali processi biotecnologici per la produzione di piante officinali transgeniche e di metaboliti secondari di interesse farmaceutico, insieme alle tecniche più importanti di conservazione del germoplasma per la tutela della biodiversità di una data specie.

Su richiesta dello studente (via e-mail e in data precedente al giorno dell’esame) è possibile sostenere l’esame in forma orale in alternativa al test scritto.

La verifica dell’apprendimento potrà essere effettuata anche per via telematica, qualora le condizioni lo dovessero richiedere.

1) Parlare dei terreni di coltura

2) Parlare delle tecniche di sterilizzazione e di indessaggio

3) Parlare dei fitoregolatori di crescita

4) Parlare della coltura di sospensioni cellulari

5) Parlare della produzione di metaboliti secondari

6) Parlare dell'isolamento e fusione di protoplasti

7) Parlare delle techiche di ingengneria genetica OGM e PGM